Медогонки и воскотопки Плазма 29.06.18 Пробиокс Весы пчеловодные беспроводные

Важно ...

Вы еще не зарегистрировались на нашем форуме? Зря, очень зря... Только зарегистрированные пользователи имеют возможность пользоваться огромной библиотекой книг о пчеловодстве (около 1300 изданий), фото-галереей (около 4000 фото), и картой пользователей, где можно найти пчеловода-земляка по карте области, почитать статьи посетителей, расширенным поиском, сводкой погоды в своем городе и многое-многое другое... Узнайте все возможности пчеловодного форума! Регистрация здесь !

Скрыть объявления

Объявления

История съездов: 1 (Ярослав. обл), 2 (Нижегор. обл), 3 (Белоруссия), 4 (Москва), 5 (Украина), 6 (Украина), 7 (Калуж. обл), 8 (Москов. обл), 9 (Татарстан), 10 (Казахстан), 11 (Рязанская обл) , 12 (Москов. обл)

 Ответить  Открыть тему  Создать опрос

Древовидный · [ Стандартный ] · Линейный

> Искусственное осеменение маток, Обмен опытом и информацией

Виктор Андреев    Skype
Понедельник, 19 Августа 2019, 9:21
Сообщение #2026





Ульи: многокорпусные
Порода пчёл: Карника
Пчело-стаж: 7-15 лет
Пчелосемей: 20-30
Регион нахождения пасеки: Россия, Крым

[>]


Что по вашему
Цитата(Guscha @ Воскресенье, 18 Августа 2019, 20:59)
как с технической точки зрения он получает репродукционных маток?
*




--------------------
Душу -БОГУ, Сердце -ЖЕНЩИНЕ, Жизнь - ОТЕЧЕСТВУ, Честь - НИКОМУ
 ON  Карточка  Приват
 Наверх
курил    Skype
Понедельник, 19 Августа 2019, 9:42
Сообщение #2027





Ульи: многокорпусные Рут
Порода пчёл: помесь
Пчело-стаж: 20-30 лет
Пчелосемей: 30-40
Регион нахождения пасеки: Россия, Ростовская обл.

[>]


Цитата(Guscha @ Воскресенье, 18 Августа 2019, 20:59)
Или он трутней берёт с иной пасеки? hmm.gif
*

Берёт трутня от племенных семей, которых надо или метить или каким то образом изолировать от попадания в к этим трутням сторонних трутней. Миграция трутня на пасеке видна, когда завёл немного Итальянки. В этом году сутки стоял с пасекой Итальянки, через месяц увидел итальянского трутня. Как то так.
 OFF  Карточка  Приват
 Наверх
Bikanin  
Понедельник, 19 Августа 2019, 10:51
Сообщение #2028





Ульи: Апирусс, Нижегородец, павильон, рамка R
Порода пчёл: Карника своей линии
Пчело-стаж: 7-15 лет
Пчелосемей: 50-70
Регион нахождения пасеки: Россия, Ярославская обл.

[>]


Цитата(Guscha @ Понедельник, 19 Августа 2019, 9:43)
меня больше интересует техническая сторона вопроса
*


В принципе, сам процесс осеменения матки такой же. Единственно, осеменять можно в один или в два приема.imho.gif


--------------------
Временно не пишу сообщений. Отвечаю в привате и на letok.info.
 OFF  Карточка  Приват
 Наверх
zames  
Четверг, 29 Августа 2019, 16:11
Сообщение #2029





Ульи: Лежаки ,Рутт
Порода пчёл: Украинская степная
Пчело-стаж: 3-7 лет
Пчелосемей: 10-20
Регион нахождения пасеки: Украина

[>]


Все.Собрал))
Прикрепленное изображение
Прикрепленное изображение


--------------------
Русские не сдаются!
 OFF  Карточка  Приват
 Наверх
курил    Skype
Четверг, 29 Августа 2019, 18:06
Сообщение #2030





Ульи: многокорпусные Рут
Порода пчёл: помесь
Пчело-стаж: 20-30 лет
Пчелосемей: 30-40
Регион нахождения пасеки: Россия, Ростовская обл.

[>]


zames Красавец friends.gif
 OFF  Карточка  Приват
 Наверх
Юрий В.  
Четверг, 29 Августа 2019, 21:56
Сообщение #2031





Ульи: многокорпусные рамка 230.300
Порода пчёл: Карника
Пчело-стаж: 20-30 лет
Пчелосемей: 150-300
Регион нахождения пасеки: Россия, Крым

[>]


Цитата(zames @ Четверг, 29 Августа 2019, 16:11)
Все.Собрал))


*


Оптика ,подсветка хорошая нужна ,еще баллон углекислотный

Цитата(zames @ Четверг, 29 Августа 2019, 16:11)
Все.Собрал))


*


Оптика ,подсветка хорошая нужна ,еще баллон углекислотный и редуктор с ратометром и обучение проходить нужно ,секретов нет ,есть нюансы и по трутню и по настройке станка - правильный угол ,физрастворы ,стерильность ,вообщем нужен хороший наставник.
 OFF  Карточка  Приват
 Наверх
zames  
Пятница, 30 Августа 2019, 16:07
Сообщение #2032





Ульи: Лежаки ,Рутт
Порода пчёл: Украинская степная
Пчело-стаж: 3-7 лет
Пчелосемей: 10-20
Регион нахождения пасеки: Украина

[>]


Цитата(курил @ Пятница, 30 Августа 2019, 1:06)
zames Красавец friends.gif
*


drinks_cheers.gif


Цитата(Юрий В. @ Пятница, 30 Августа 2019, 4:56)
Оптика ,подсветка хорошая нужна ,еще баллон углекислотный и редуктор с ратометром и обучение проходить нужно ,секретов нет ,есть нюансы и по трутню и по настройке станка - правильный угол ,физрастворы ,стерильность ,вообщем нужен хороший наставник.
*



Да, Вы правы , еще довольно многое нужно, чисто техническое оборудование, хотя уже многое есть в наличии)
Самое главное это освоить технологию) вот где "жара" предвидится)))
Но как известно , дорогу осилит идущий, а там как Бог даст ...

Сообщение отредактировал zames - Пятница, 30 Августа 2019, 16:08


--------------------
Русские не сдаются!
 OFF  Карточка  Приват
 Наверх
koste U  
Вторник, 05 Ноября 2019, 15:40
Сообщение #2033





Ульи: Мнагокорпусные
Порода пчёл: Карника
Пчело-стаж: 20-30 лет
Пчелосемей: 20-30
Регион нахождения пасеки: Украина

[>]


Российская академия сельскохозяйственных наук
ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПЧЕЛОВОДСТВА












ТЕХНОЛОГИЯ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ СПЕРМЫ ТРУТНЕЙ В ЖИДКОМ АЗОТЕ








Москва - 2007
Технология разработана зав. отделом селекции пчел, доктором с.-х. наук А.В.Бородачевым, старшим научным сотрудником отдела селекции пчел О.В.Кабашовой.Рассмотрена и одобрена на заседании секции пчеловодства Отделения зоотехнии Россельхозакадемии 24.09.2007
© Россельхозакадемия, 2007 ГНУ НИИ пчеловодства, 2007
ВВЕДЕНИЕ
Вымирание отдельных видов, подвидов и пород животных, местных сортов и диких родичей культурных и лекарственных растений приводит к нарушению сложившегося равновесия в природе и может иметь серьезные экологические последствия. Поэтому одной из важных задач современной генетики является сохранение генетического биоразнообразия, что невозможно без организации криобанков, условием создания которых служит разработка методов криоконсервации спермы и эмбрионов.
Использование этих методов может способствовать сохранению генетической структуры популяции in situ. Применение методов криоконсервации позволит получать потомство от разных видов, при этом облегчается транспортировка генетического материала на большие расстояния; возможен ретроспективный анализ генетического материала - основателей, сохраняются ценные генетические линии, и повышается репродуктивный потенциал лучших производителей.
Глубокое замораживание в жидком азоте - наиболее перспективный способ консервации генома. Оно стало возможным благодаря успехам криобиологии, изучающей изменения, происходящие в организмах при замораживании, и механизмы устойчивости к действию низких температур. Благодаря этим исследованиям, разработаны режимы замораживания живых объектов и среды, в которых производится замораживание.
В настоящее время удается замораживать и хранить в жидком азоте при температуре -196° половые клетки, гонады, многие соматические клетки ранних зародышей и ряд органов животных, а также семена, пыльцу и меристему растений. Однако следует иметь в виду, что детали метода приходится разрабатывать специально к каждому объекту.
Замораживание спермиев - одна из наиболее разработанных областей криобиологии. В настоящее время метод разработан для свыше 80 видов млекопитающих, 10 видов птиц, 20 видов рыб, амфибий, рептилий, 10 видов беспозвоночных. Наибольшее практическое применение метод имеет при разведении крупного рогатого скота, что позволяет эффективно и продолжительное время использовать выдающихся производителей.
Разработка приемов и технических средств длительного сохранения жизнеспособной спермы трутней имеет исключительно важное значение для селекционной работы в пчеловодстве.
Выведение чистых линий медоносных пчел методом инбридинга практически невозможно без инструментального осеменения пчелиных маток спермой трутней, сохраняющейся, по крайней мере, в течение одного года. Для этого требуется сохранение спермы одной породы и генерации в течение развития 2-3 поколений маток. В условиях Рязанской области можно вывести в течение весны, лета до двух поколений маток.
При инбредном разведении, применяемом для консолидации признаков и ликвидации расщепления, требуется осеменять маток дочерних и внучатых поколений спермой одной и той же породной группы и генерации.
Были выявлены основные условия для успешного криохранения спермы трутней медоносной пчелы, а именно применение богатой питательной среды С46 в качестве разбавителя, использование проникающего криопротектора ДМСО, замораживание со скоростью 1°/мин, последующее оттаивание при температуре 40° и отмыв спермы от криопротектора свежей средой.
СОДЕРЖАНИЕ ТРУТНЕЙ APIS MELLIFERA L
В каждой пчелиной семье поддерживается биологически обоснованное равновесие между соотношением особей. Количество трутней в семье регулируется пчелами, а фактором, влияющим на этот показатель, является феромон, выделяемый самими трутнями. Поэтому при выведении трутней в отцовских семьях на протяжении всего репродуктивного сезона необходимо создавать наиболее благоприятные условия.
Подготовка отцовских семей имеет решающее значение, обеспечивая к моменту отбора спермы на хранение возможность выращивать необходимое количество трутней и контролировать их качество.
Трутни, выращенные в здоровых, сильных семьях при хорошем кормлении в стадии личинки и в первые дни имагоидальной стадии, более жизнеспособны, они крупнее, обладают спермой высокого качества.
Ю.А.Черевко считает, что выделение отцовских семей и снабжение их необходимыми запасами перги и меда необходимо проводить осенью.
M.D.Allen считал, что постановка пчелиным семьям с весны трутневых сотов также увеличивает количество выращенных трутней.
И.И.Хруст показал, что ежедневная подкормка увеличивает количество выращенных трутней и их массу. При раннем выращивании трутней пчелиные семьи должны быть обеспечены в достаточном количестве белковым и углеводным кормом.
Отцовские пчелиные семьи выделяют из числа наиболее продуктивных, зимостойких, здоровых и типичных для размножаемой породы или линии пчел.
Поскольку в сильных пчелиных семьях всегда имеется достаточно пчел-кормилиц, способных выращивать полноценных трутней, для этого подбирают такие семьи и обеспечивают за ними надлежащий уход. Лучше всего их вывезти в места с поддерживающим медосбором. Если нет такой возможности, то пчелиные семьи обеспечивают медопыльцевой подкормкой. При сборке гнезд на зиму в середину гнезда ставят трутневые соты, в которых наряду с пчелиными ячейками имеются и трутневые. В такие соты матки весной охотнее откладывают яйца. Чтобы ускорить начало выращивания трутневого расплода, отцовские семьи выставляют из зимовника для очистительного облета на две недели раньше обычного срока.
С этой же целью отцовские семьи ставят в зимовку с матками-трутовками. Такие семьи выходят из зимовки с молодыми трутнями в гнезде. Чтобы получить матку-трутовку, от племенной матки выводят дочерей, которых трехкратно с суточным интервалом в течение 10 мин обрабатывают углекислым газом. Обработанную матку выдерживают в клеточке 5-10 дней, а затем подсаживают в сильную, подготовленную для этих целей семью. Весной семье с маткой-трутовкой обязательно периодически ставят рамки со зрелым расплодом от других семей.
Выставленные из зимовника отцовские семьи обрабатывают от варроатоза, гнезда их сокращают, освобождают от подмора, хорошо утепляют, если нужно - подсиливают и дают побудительную подкормку с белковыми добавками. Желательно до появления в природе пыльцы семьи кормить медоперговой смесью, а также добавлять им в кормушки теплую воду.
Белковый корм трутни получают в течение первых дней жизни, когда у них происходит накопление и созревание спермиев. Замечено, что в течение одного часа пчелы дают корм только что вышедшему из ячейки трутню от 22 до 33 раз. Только на пятые сутки жизни трутни способны самостоятельно брать корм из ячеек.
Часто пчелы начинают изгонять трутней среди лета при временном прекращении медосбора. В этом случае отцовские семьи начинают подкармливать или отбирают у них матку. Безматочные семьи трутней не изгоняют, они выращивают трутней дольше и лучше, чем нормальные семьи.
Иногда очень трудно получить трутневый расплод от молодых плодных маток, а также вырастить трутней в семьях с инбредными матками. Предложено несколько способов получения трутней в любые сроки сезона.
1. Заключение матки на трутневом соте в рамочном изоляторе из разделительной решетки. Изолятор с маткой ставят между сотами с расплодом. Через трое суток сот с яйцами вынимают из изолятора и ставят в гнездо, а матке в изолятор ставят новый.
2 Получение яиц от маток-трутовок. Обработка неплодной матки углекислым газом описана выше. Трутовку можно получить и весной путем охлаждения плодной матки при t = 0-5° в течение 6-8 часов два дня подряд. Во время обработки матка впадает в оцепенение, затем при обычных температурах она приходит в нормальное состояние и в течение 10 дней откладывает исключительно неоплодотворенные яйца.
3. Побуждение пчел к откладыванию яиц. Формируют отводок из молодых пчел, которых стряхивают на трутневые соты. Пчел обычно кормят белковым кормом, и у них начинают функционировать яичники. Примерно через 10 дней пчелы начинают откладывать яйца. Желательно соты с трутневым расплодом от таких семей переставлять на воспитание сильным семьям с целью улучшения качества трутней.
Семьи с пчелами-трутовками, с матками-трутовками периодически подсиливают сотами с расплодом. Семьи с пчелами-трутовками лучше подсиливать сотами с печатным расплодом, так как воспитывая молодых личинок, пчелы-трутовки могут потерять способность откладывать яйца.
Трутни, полученные от маток-трутовок и пчел-трутовок, при правильном воспитании по развитию и производству спермы отвечают необходимым требованиям и безусловно являются потомством племенной семьи.
Существенное значение приобретает получение полноценных трутней в связи с варроатозом. Известно, что при наличии в семье трутневого расплода клещ варроа предпочитает его пчелиному. Трутни, выращенные в семьях, пораженных этой инвазией, характеризуются меньшей массой, продуцируют небольшое количество спермы, часто нежизнеспособны. Чтобы получить
полноценных трутней, необходимо использовать наименее пораженные варроатозом пчелиные семьи, обработанные акарицидными препаратами после весенних облетов до появления трутневого расплода.

Содержание племенных трутней.
Содержать отцовские семьи необходимо вблизи лаборатории, доступными для работы в любое время. Разработано несколько способов содержания племенных трутней:
• в инкубаторах вне улья;
• в различных клеточках из разделительной решетки, помещенных в отцовские семьи;
• в одном из корпусов, отделенном от дна улья решеткой. Трутни свободно перемещаются по сотам гнезда, но вылета на волю не имеют;
• с применением различных летковых заградителей;
с применением облетников для трутней, изготовленных из марли или сетки, натянутых на каркас. Облетники можно устанавливать с другой стороны улья, чтобы не мешать лету пчел. В часы лета трутней открывают леток и перед ним устанавливают облетник, в который они вылетают. В таких облетниках также наблюдают за гибелью трутней.
Эти методы предусматривают содержание трутней с частичным их облетом или без него. Они трудоемки и сокращают жизнь трутней. Отбирать сперму от таких трутней неудобно, так как они часто испражняются во время отбора спермы.
Лучшим является метод, при котором трутни имеют свободный вылет из улья. При использовании этого метода обязательно мечение трутней. За два дня до выхода трутней из ячеек сот помещают в рамочный изолятор из разделительной решетки и ставят его между сотами с расплодом. Можно изолятор с трутневым расплодом поместить в инкубатор-термостат.
ВОЗРАСТ И ПОЛОВОЕ РАЗВИТИЕ ТРУТНЯ
Только, что выведшиеся трутни еще незрелы в половом отношении. Хотя большинство спермацитов развились в зрелые спермин, но их передвижение из семенников в семенные пузырьки только начинается. Перемещение спермиев начинается только через 2-3 дня после выхода трутня. Выделение слизи (мукуса) также начинается после вылупления трутня. Поэтому часто у молодого трутня можно вызвать выворачивание эндофаллуса, но без выделения семени.
На восьмой день после выхода трутня семенные пузырьки уже полностью заполнены спермиями, а семенники сжимаются до одной четверти их первоначальных размеров. В семенных пузырьках спермии проходят вторую стадию созревания (физиологический процесс). Спермин прикрепляются головками к железистым клеткам стенки и остаются в состоянии покоя несколько дней. В течение этого времени содержимое железистых клеток выделяется в пространство между спермиями. Таким образом, семенной пузырек превращается из толстостенной железы в более тонкостенный мешок, который плотно наполнен спермой. В процессе созревания увеличивается подвижность спермиев.
В то же время в придаточных железах начинает выделяться мукус. Сперма и мукус до момента эякуляции содержатся раздельно.
ВЛИЯНИЕ ЛЕТНОЙ АКТИВНОСТИ НА ПОЛОВОЕ СОЗРЕВАНИЕ ТРУТНЕЙ
Первые вылеты, которые начинаются на 7-10-й день жизни трутней, еще не свидетельствуют о половой зрелости. После того как закончится развитие спермиев в трубочках семенников, зрелые спермии переходят в семенные пузырьки. Этот процесс заканчивается через 6-9 дней после вылупления трутней из ячеек. Придаточные железы максимально заполняются мукусом на 5-6-й день. Многие трутни уже на 10-й день выворачивают эндофаллус, но максимальная способность к его выворачиванию появляется не раньше 12-дневного возраста.
Существуют противоречивые сообщения относительно стимулирующего влияния полетов на способность трутней к выворачиванию эндофаллуса. Е.Войке (1955) считает, что подобного влияния нет, Н.М.Куренной (1953) придерживается противоположного мнения. Исследования В.Миндта (1961) показали низкую возбудимость трутней до первого полета. Только 12 % трутней, не производивших первого полета, при обезглавливании выворачивали эндофаллос; после первого полета выворачивание наблюдалось у 52 % трутней.
Возбуждение, необходимое для выворачивания эндофаллоса, начинает происходить через 10 мин после активного полета. Если дать возможность трутням вибрировать крыльями, держа их в руке, это может заменить активный полет. O.Mackensen (1955) нашел, что у свободно летающих трутней пригодной спермы больше на 10 %, чем у трутней, лишенных вылета.
ВЛИЯНИЕ СЕЗОНА И ВОЗРАСТА ТРУТНЯ НА СПЕРМУ
Известно, что соотношение сперма : семенная жидкость варьирует от 1:1 до 1:2 и зависит от климатических условий; первое соотношение преобладает в начале сезона.
Н.Линд (1962) исследовал способность трутней к выворачиванию эндофаллуса и определил, что при использовании одних и тех же стимуляторов в мае давали выворачивание 76 % трутней, в июне 92 %, а в июле 95 % трутней.
Среди трутней майского вывода 21 % бесплодных, в июне и июле их количество составило соответственно 7,4 и 1 % -Л.Кепена (1963), значит, в ранние сроки важно добиваться получения не общего количества трутней, а полноценных способных к спариванию.
An Chwatkouyki (1970) сообщил, что потери инструментально осеменненых и естественно спаренных маток закономерно уменьшаются от весны до середины лета, достигая минимума в третьей декаде июня, а затем возрастают, достигая максимума в конце лета. Предполагается, что гибель маток происходит с отцовской стороны и зависит от семени.
Масса семенных пузырьков увеличивается с возрастом. Если первые дни жизни масса семенных пузырьков равна 1,5-2,5 мг, то у зрелых трутней - 3,5-4,5 мг. Концентрация спермы также изменяется с возрастом и становится высокой с восьмого дня жизни трутня 4,5-8,0 млн. в 1 мл.
А.В.Молодюк (1979) изучая физиологию спермиев трутня медоносной пчелы, особенности обменных процессов, выяснил, что с 16-го по 20-й день с момента выхода имаго резко снижается активность некоторых оксидоредуктаз, катализирующих окислительно-востановительные реакции, лежащие в основе биологического окисления и полное их отсутствие в возрасте 45 дней.
Наибольшее количество жизнеспособной спермы накапливается в семенных пузырьках трутней достигших 12-17-дневного возраста. В это время сперма лучше всего поддается извлечению из половых органов трутня и наиболее пригодна для отбора на хранение и инструментальное осеменение.
ОРГАНЫ РАЗМНОЖЕНИЯ ТРУТНЯ
Половые органы трутня занимают большую часть брюшка и состоят из парных семенников, парных семенных пузырьков, придаточных желез и эндофаллоса.
Семенники расположены в передней части брюшка. Это очень нежные, мягкие тельца длиной 5-6 мм. Состоят они из многочисленных семенных канальцев (до 200). Просвет каждого канальца заполнен спермиями всех стадий развития. Все семенные канальцы впадают в чашеобразное расширение, от которого отходит узкий извилистый семяпровод.
Семяпровод, расширяясь, образует семенной пузырек. Стенки семенных пузырьков утолщены за счет мощных слоев мускулатуры. Сильно развитая мускулатура семенных пузырьков играет важную роль в процессе выведения семени при копуляции. Внутренний слой семенных пузырьков - железистые клетки, которые выделяют секрет, питающий сперматозоиды. В конце семенного пузырька от внутреннего слоя выделяются прозрачные вакуоли, которые образуют губчатую пробку, препятствующую выходу спермиев.
Придаточные железы - это два слегка изогнутых образования цилиндрической формы, длиной 6-7 мм. Внутренний слой придаточных желез состоит из железистых клеток, вырабатывающих мукус. За железистыми клетками идут продольные и кольцевые мышцы. Наиболее сильная мускулатура находится вокруг концевой камеры придаточной железы, в которую впадают семяпровод и семяизвергательный канал. Выходу мукуса из придаточной железы препятствует тонкая пленка, которая прорывается под давлением мукуса, усиливающемся при сжатии мускулатуры.
Копулятивный орган трутня - эндофаллос, состоит из семяизвергательного канала, луковицы, шейки и основания с двумя парными рожками.
Выводной проток эндофаллоса выходит в клоаку, которая открывается между хитиновыми пластинками наружу.
ОБОРУДОВАНИЕ ЛАБОРАТОРИИ
• Аппарат для инструментального осеменения маток со шприцем большого объема.
• Ламинарный шкаф-бокс.
• Система замораживания с устройством электронного программирования для ампул.
• Сосуды Дьюара, криогенный контейнер для транспортировки.
• Микроскоп биологический бинокулярный.
• Микроскоп биологический исследовательский.
• Баллон с углекислым газом.
• Бактерицидная лампа.
• Центрифуга.
• Весы.
• РН-метр.
• Холодильник.
• Комплект микродозаторов.
• Штатив для микродозаторов.
• Электрокалорифер.
• Кондиционер.
• Лабораторная посуда: стаканы, колбы, бюксы.
• Водяная баня.
• Предметные стекла, покровные стекла.
• Камера Горяева.
• Садки энтомологические.
• Фиалы, ампулы для замораживания.
• Штатив для ампул.
• Пинцеты, корнцанги, щипцы, скальпели, лотки из нержавеющей стали.
• Шприцы одноразовые.
• Термометры.
• Часы-секундомер.
• Спецодежда (халаты, перчатки, защитные очки).

• МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ
• Фильтровальная бумага.
• Марля, вата.
• Жидкий азот.
• Среда С46
• Криопротектор.
• Глюкоза, фруктоза.
• Дистиллированная вода ОСЧ.
• Спирт-ректификат.
• Физиологический раствор.
• Диметилсульфоксид.

Схема замораживания спермы трутней Apis mellifera L.


Обязательным условием при отборе спермы на хранение является использование трутней сразу же после изъятия их из семей, так как они очень быстро теряют активность.
Трутня, совершившего эякуляцию, подносят к наконечнику шприца и оттягивают поршень, чтобы набрать немного воздуха для разделения солевого раствора и спермы. Затем поверхностью семенной капельки касаются кончика шприца под углом 45°. Если трутня слегка оттянуть назад от шприца, сохраняя контакт между шприцом и капелькой семени, то сперма остается приклеенной к шприцу, и будет входить в него в момент оттягивания поршня. Эта процедура помогает избежать набирания мукуса. Однако густой мукус также может попасть в наконечник шприца и остановить прохождение спермы. В этом случае подают поршень обратно, пока не очистят проход, затем возобновляют отбор спермы. Сперму отбирают под микроскопом при 8-16-кратном увеличении.
Для того, чтобы набрать капилляр на 100 мкл, необходимо вызвать эякуляцию более чем у 150 трутней. При отборе спермы контролируют объем эякулята, по цвету определяют концентрацию спермиев в эякуляте; чем темнее сперма, тем выше их концентрация. Трутни, испражнившиеся во время эякуляции, выбраковываются.
Трутней собирают у летка во время их возвращения из очистительного облета, обычно в 13-16 ч, иногда позже. Это лучшие трутни.
Однако, иногда такое бывает невозможным из-за погоды или по другой причине. Тогда трутней отбирают из гнезда, при этом важно собрать половозрелых трутней, которые обычно располагаются на крайних сотах. Для гарантии, если трутней не метили соответствующим возрасту цветом, их можно прижать к соту, вызывая характерное жужжание. Таких трутней набирают в энтомологические садки. Количество трутней в одном садке должно быть не более 220.
САНИТАРНЫЕ УСЛОВИЯ
Сперма, фекальные массы являются идеальной средой для развития микрофлоры, в т.ч. возбудителей болезней. Учитывая это, необходимо строго соблюдать условия гигиены.
В лаборатории следует поддерживать безупречную чистоту, температуру воздуха 25-28 0 и влажность 80 %, в помещении не должно быть мертвых или блуждающих пчел.
Поверхность рабочего стола, стен и пола должна иметь гладкое покрытие, регулярно протираться моющими средствами. Руки моют дезинфицирующими средствами (пальцы, которые дотронулись до фекалий трутней, считаются опасным источником заражения).
До начала работы на 15 мин включают бактерицидную лампу, 70° спиртом с добавлением 0,1 % йода стерилизуют все детали аппарата для инструментального осеменения. Спирт и другие дезинфицирующие средства не должны соприкасаться с маткой или спермой.
Заполняют 4 стеклянных стаканчика объемом 50 мл:
1. кипяченая дистиллированная вода
2. кипяченая дистиллированная вода
3. физиологический раствор
4. физиологический раствор
В бюксе с притертой крышкой держат 70° спирт с добавлением 0,1 % йода.
Вату, марлевые салфетки и полотенца автоклавируют.
Для заполнения шприца используют 0,9 %-ный стерильный солевой раствор.
После отбора спермы и осеменения маток на стенках стеклянного капилляра остается сперма, которую необходимо вымывать стерильным солевым раствором, так как свежие накопления смываются очень легко.
После окончания работы проводят тщательную очистку и дезинфекцию всех инструментов и оборудования.
Сперму, соприкоснувшуюся с телом трутня, с его гемолимфой, фекалиями или с пальцами оператора, не используют.
ВЫБОР И ПОДГОТОВКА КОНТЕЙНЕРОВ ДЛЯ ЗАМОРАЖИВАНИЯ СПЕРМЫ

Сперму можно замораживать в ампулах с завинчивающейся пробкой (Nunc, Kamstrup, Дания), пробирках с коническим дном типа Eppendorf (Ахудеп.США) или пластиковых соломинках (ANV, L'Aigle, Франция).
Предлагаем использовать пластиковые ампулы с завинчивающейся пробкой на 1 мл фирмы Nunc (Дания) по следующим соображениям:
• Большой объем ампулы упрощает маркировку и последующую идентификацию образца.
• Вероятность случайного нагревания образца сравнительно большего объема, который находится в ампуле, ниже, чем при использовании паеты (средний объем которых 0,2-0,3 мл и 20-40 мл).
• Удобство в работе по удалению криопротектора, центрифугированию и последующему использованию спермы для инструментального осеменения.
• Завинчивающаяся крышка позволяет надежно закрывать образцы и не позволяет жидкому азоту проникать в ампулу.
• Перед началом работы на поверхность ампулы ставится порядковый номер и дата замораживания. Все остальные данные заносятся в журнал.
ВЫБОР СРЕДЫ ДЛЯ СПЕРМЫ
Эффективность низкотемпературного замораживания в значительной степени зависит от состава используемых синтетических сред. Эти среды должны содержать неэлектролиты, электролиты, фосфолипиды, антиоксиданты, биологически активные вещества, антибиотики и другие вещества, которые призваны обеспечить сохранение биологической полноценности спермиев в процессе технологической обработки спермы. Кроме того, они должны создать оптимальные для спермиев условия рН, осмотического давления, электропроводности, буферное™ и т.д.
Защитные среды должны быть простыми и способствовать торможению метаболических процессов в спермиях.
В настоящее время обязательным компонентом питательных сред является белок, добавленный в виде эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Роль белка в культуральной среде до конца не ясна, вместе с тем, добавление в среду сыворотки или альбумина неизбежно увеличивает жизнеспособность спермиев.
Работы S.S.Kakar и S.R.Ananol (1981) подтверждают предположение, что потеря спермиями подвижности может быть связана с уменьшением запаса веществ, обеспечивающих их жизнеспособность. Поскольку активность спермиев связана с энергетическими затратами, а наиболее легко метаболизирующимися являются простые углеводы. H.K.Poole и J.F.Edvarads (1972) показали, что глюкоза, фруктоза и сахароза индуцируют увеличение двигательной активности спермы.
Поэтому при разбавлении спермы перед замораживанием в среде была увеличена концентрация CaCI2 и глюкозы. Считается, что введение Сахаров заставляет спермии поддерживать свою жизнедеятельность в анаэробных условиях, экономя расходование липидов семени на дыхание. Увеличение глюкозы в среде позволяет включить ее в обмен, но не накапливаться, а, немедленно расщепляясь, превращаться в молочную кислоту.
Однако, накопление молочной кислоты делает среду непригодной для жизнедеятельности спермиев. Поэтому после оттаивания для вывода криопротектора и реанимации спермиев концентрацию глюкозы в среде оставили на прежнем уровне, но увеличили количество глутаминовой кислоты, обеспечивающей поддержание целостности мембран.
Использование данного приема позволило увеличить переживаемость спермы после оттаивания на 5 ч и максимально она составила 72 ч.
РАЗБАВЛЕНИЕ СПЕРМЫ
Автоматической пипеткой внести в маркированную ампулу 1 мл среды С4е Поместить сперму от 100 трутней в среду.
Успех криоконсервации многих видов животных связан с необходимостью постепенного охлаждения спермы до 4° и выдерживания в течение нескольких часов.
Работы Y.S.R.Peng (1984) доказали, что сперма устойчива к холодовому шоку, поэтому этап эквилибрации (уравновешивания при температуре бытового холодильника) продолжается 20 мин. Этого времени достаточно для адаптации спермиев в искусственной среде и устранения вредного влияния разбавления, охлаждения и замораживания.
КРИОПРОТЕКТОР
Достижения в области глубокого замораживания спермы связаны с открытием защитных веществ - криопротекторов.
К криопротекторам относятся компоненты синтетических сред, играющие роль стабилизаторов воды и способствующие предотвращению или снижению изменений, наступающих при замораживании биологических объектов.
При подборе криопротектора обращают внимание на то, чтобы они имели небольшой молекулярный вес, хорошо растворялись в воде и смешивались с другими растворителями, проникали в клетки и были нетоксичными для них в большом количестве.
Рекомендуем к использованию эндоцеллюлярный криопро-тектор диметилсульфоксид (ДМСО). Механизм его защитного действия в том, что он, проникая внутрь клетки противосолевого буфера, позволяет вызывать переохлаждение системы путем связывания части свободной воды, что способствует протеканию витрификационных процессов и укрепляет мембраны клеток, предохраняя их от повреждающего действия воды при перераспределении ее по обе стороны мембраны.
Однако, наряду с положительным влиянием, он оказывает токсическое действие на спермии.
Высокая выживаемость спермы трутней наблюдается после замораживания в среде, содержащей ДМСО в концентрации от 10 до 40 %. В концентрациях меньше 10 % он не проявляет эффективного защитного действия, а в концентрациях 40 % ДМСО оказывается токсичным.

При смешивании ДМСО с замораживаемой средой выделяется значительное количество тепла. Поэтому прямо в сперму неразбавленный ДМСО не вносят, вместо этого готовят его 3,0 М раствор и к сперме добавляют аликвоту, достаточную для получения конечной концентрации ДМСО 10 %. К образцам весь необходимый объем ДМСО добавляется сразу.
ОЦЕНКА СПЕРМЫ ПЕРЕД ЗАМОРАЖИВАНИЕМ
Поскольку замечено, что у медоносной пчелы существует индивидуальная, породная, сезонная изменчивость отношения спермы к охлаждению и замораживанию, необходимо проводить ее оценку до и после замораживания-оттаивания.
Выбор методов, позволяющих прогнозировать результаты криоконсервации спермы трутней, является важным условием получения стабильных результатов при замораживании.
В случае работы со спермой трутней, оценивают весь образец спермы, а не эякулят каждого трутня.
Перед замораживанием сперму оценивают по основным показателям:
1. подвижность;
2. концентрация;
3. количество мертвых и патологических форм спермиев;
4. переживаемость;
РЕЖИМ ЗАМОРАЖИВАНИЯ
Стабилизация биологических свойств спермиев в значительной степени зависит от скорости снижения температуры от +4 до -196°. Скорость снижения температуры при замораживании спермы зависит от способа замораживания, состава защитных средств и вида животного. Необходимо выбрать такой режим снижения температуры, чтобы довести до минимума кристаллизацию свободной воды и быстро перейти к фазе витрификации.
Ампулы со спермой замораживают со скоростью 1°/мин до температуры -70° в парах жидкого азота с помощью программного замораживателя, а затем погружают в жидкий азот.
При перенесении образцов в сосуд для длительного хранения следует охладить алюминиевый контейнер для ампул в жидком азоте и с помощью длинного пинцета, концы которого предварительно охлаждены в жидком азоте, загрузить контейнеры для хранения.
ХРАНЕНИЕ СПЕРМЫ
Сперма хранится в стационарных биологических хранилищах. Необходимо, чтобы образцы находились все время в жидком азоте при постоянной температуре -196°. Даже небольшое ее повышение (вынимание ампул из жидкого азота на несколько минут) отрицательно влияет на качество спермы и выживаемость спермиев. Поэтому ампулы помещают в стаканы, при извлечении стаканов из хранилища ампулы остаются погруженными в жидкий азот и не подвергаются колебаниям температуры.
Можно использовать криогенные контейнеры для хранения и транспортировки образцов в жидком азоте. Они обеспечивают низкий уровень испарения азота, имеют прослойку суперизолирующей фольги и области вакуумного пространства.
Для сохранения спермы трутней можно использовать:
криохранилища длительного хранения и транспортировки образцов (от 40 до 172 л).
сосуды Дьюара для транспортировки закрытого типа из боросиликатного стекла, закрывающиеся пластиковыми крышками с клипсами (от 1 до 4 л).
Предлагаемый метод криоконсервации обеспечивает сохранение 80-95 % жизнеспособных спермиев после хранения в жидком азоте более 10 лет.
РАЗМОРАЖИВАНИЕ
Размораживание образцов проводят в водяной бане при температуре 40° в течение 30 с до получения жидкой фракции.
Поскольку охлаждение образца ведется в присутствии проникающего криопротектора, возникает необходимость удалить его после размораживания клеток, чтобы избежать их повреждения в результате осмотического шока.
После того, как в ампуле растает лед, через 5 мин, чтобы образец приобрел комнатную температуру, добавить 1 мл свежей среды С46 и тщательно перемешать.
Отцентрифугировать в течение 3 мин при 3000 оборотах.
Одноразовым шприцем отобрать надосадочную жидкость.
Добавить в ампулу 1 мл свежей среды С46, тщательно перемешать и оставить на 10 мин.
Отцентрифугировать в течение 3 мин при 3000 оборотах.
Отобрать надосадочную жидкость.
Центрифугирование дает возможность концентрировать сперму, позволяя использовать обычные объемы спермы для инструментального осеменения с необходимым количеством спермиев 5 млн.
ОЦЕНКА КАЧЕСТВА СПЕРМЫ ПОСЛЕ ХРАНЕНИЯ
В связи с практическим применением метода низкотемпературного замораживания спермы трутней, большое значение приобретает разработка надежных методов определения ее качества после размораживания, перед осеменением и, прежде всего, ее биологической полноценности. При этом основное внимание уделяется тем показателям, которые коррелируют с оплодотворяющей способностью спермы. Наиболее простым методом является определение подвижности спермиев после оттаивания спермы.
Процент подвижных или активных спермиев оценивают под микроскопом через 30 мин после оттаивания по 5-балльной шкале (O.Kaftanoglu, Y.S.R.Peng, 1984):
• 5 - все подвижные
• 4 -1 % неподвижных
• 3-50 % подвижных
• 2 - 20 % подвижных 4
• 1 -1 % подвижных.
Для объективности оценки активности необходимо использовать и другие показатели жизнедеятельности спермиев.
Метод определения числа живых и мертвых спермиев основан на принципе, что живые спермии способны двигаться, не окрашиваются, тогда как мертвые и ослабленные легко окрашиваются раствором эозина.
Однако показатели подвижности и количество живых спермиев не являются достаточно надежным критерием оценки качества спермы, так как они не всегда коррелируют с оплодотворяющей способностью спермиев.
Поэтому очень важным является показатель абсолютной переживаемое™ спермиев в часах, поскольку после искусственного осеменения сперма из яйцеводов переходит в семяприемник в течение 24-48 ч. Принцип данного метода заключается в установлении подвижности спермиев за каждый последовательный интервал времени хранения при температуре 28°, оптимальной для миграции спермиев в семяприемник матки. При этом сперма после оттаивания будет обладать следующими показателями: выживаемость при температуре 28° не менее 48 ч и абсолютный показатель живучести спермиев - 60 ч.
Хотя эти показатели дают больше информации о жизнеспособности спермиев, они не являются достаточно объективными. Поэтому необходима разработка других способов оценки спермы, учитывающих морфологические и биохимические изменения спермиев в результате их замораживания-оттаивания.
ВЫВОД И СОДЕРЖАНИЕ ПЧЕЛИНЫХ МАТОК
Материнская семья только поставляет яйца или личинок, из которых должны развиваться матки. Они подвергаются строгому отбору. Не только сама семья должна иметь высокие показатели хозяйственно-полезных признаков, но ценные признаки должны повторяться в ее потомстве. Матки таких семей во время использования их личинок для вывода маток не должны откладывать много яиц. Опыты, проведенные в Институте пчеловодства, показали, что при высокой яйцекладке матки откладывают яйца меньшей массы, из которых выводятся не лучшие матки. Масса яиц является одним из многих факторов, влияющих на качество выращиваемых из них маток. С целью увеличения массы яиц маток материнских семей содержат в изоляторах с ограниченной площадью сотов для откладки яиц.
Этот способ дает возможность еще и получить личинок одного возраста в большом количестве. Если материнская семья пришла в роевое состояние, то личинное от нее берут без предварительного ограничения яйцекладки.
Семьи-воспитательницы осуществляют функции кормилиц. Известно, что лучшими являются роевые матки. Следовательно, в семьях-воспитательницах добиваются условий, подобных тем, которые складываются в семьях в роевой период.
Этим требованиям отвечают семьи, пчелы которых занимают не менее двух корпусов улья, имеющих 9-10 сотов расплода и хорошие кормовые запасы с обилием перги, начинающие выращивать трутневый расплод. Их содержат на сжатых гнездах, и если нет поступления свежего нектара и пыльцы, дают побудительную медово-перговую подкормку. Лучших маток пчелы выращивают при наличии поддерживающего медосбора, который благоприятно влияет на развитие семей и на кормление маточных личинок.
Разработан ряд методов формирования семей-воспитательниц:
• С полным осиротением: из гнезда семьи-воспитательницы отбирают матку и весь открытый расплод, чтобы пчелы не закладывали маточники на своих личинках. При этом способе наблюдается хороший прием личинок на воспитание, но качество маток страдает.
• С неполным осиротением: из гнезда семьивоспитательницы отбирают матку, оставляя расплод всех возрастов. При этом способе качество маток улучшается, но прием личинок на маточное воспитание уменьшается.
• Без осиротения: в гнезде семьи-воспитательницы оставляют матку и расплод всех возрастов. При этом способе воспитываются матки не хуже роевых, но снижается прием личинок на маточное воспитание.
С использованием семьи-«стартера», которую формируют только для приема личинок на воспитание. Ее можно формировать, стряхивая пчел с сотов нескольких семей. Гнезда составляют из кормовых сотов. Такая семья будет состоять из большого числа молодых пчел, способных продуцировать маточное молочко. Не имея расплода, пчелы очень хорошо принимают личинок на маточное воспитание и, как правило, в маточные мисочки откладывают обилие маточного молочка. Одна семья «стартер» может обеспечить принятыми личинками четыре семьи-воспитательницы. Принятых личинок переставляют для воспитания в семьи-воспитательницы с матками и расплодом всех возрастов. Этот метод является лучшим, так как семья-«стартер» обеспечивает хороший прием личинок на маточное воспитание, а сильная семья-воспитательница с наличием матки и расплода всех возрастов создает необходимые условия для выращивания высококачественных маток.
ОРГАНЫ РАЗМНОЖЕНИЯ МАТКИ

Органы размножения матки состоят из парных яичников, парных и непарного яйцеводов, семяприемника, влагалища, преддверия влагалища и камеры жала. Яичники расположены в верхней части брюшка и состоят из большого числа яйцевых трубочек (100-200 в каждом), в которых развиваются яйца. Верхняя рыхлая оболочка их пронизана многочисленными трахеями, которые проникают внутрь яичника и тянутся вдоль стенок яйцевых трубочек.
От яичников отходят парные яйцеводы. Их стенки имеют многочисленные складки, которые увеличивают просвет, позволяющий принять большой объем спермы. Внутри стенки яйцеводов покрыты хитиновой оболочкой с короткими волосками, наружный слой состоит из продольных мышц, обеспечивающих слабое перистальтическое сокращение. Парные яйцеводы сливаются в один короткий непарный яйцевод, имеющий более развитые и кольцевые мускулы.
Семяприемник матки - это шар диаметром 0,45-1,30 мм, объемом 0,45-1,15 мм3, вмещающий 5-7 млн. спермиев. Состоит он из тонкой внутренней оболочки со слоем эпителия и хитиновой пленки и толстой, рыхлой наружной, пронизанной множеством трахей. Через клетки эпителия происходит обеспечение спермы кислородом и питанием, а также удаление углекислоты и продуктов обмена. Обилие трахей в клетках чехла указывает на интенсивные процессы обмена веществ в них. Капсула с чехлом соединяются в начале выводного протока семяприемника, сюда же впадает и проток придаточной железы, расположенной на поверхности рыхлого слоя. В месте выхода выводного протока из семяприемника образован и мускульный насос, который играет основную роль в процессе насасывания спермы в семяприемник и выведение ее на проходящее по непарному яйцеводу яйцо.
За яйцеводом следует близкое с ним по строению влага-лище. В нижней его стенке имеется полый выступ с многочисленными продольными складками, с толстым слоем хитина -влагалищный клапан. Клапан имеет сильные мышцы и может подниматься вертикально и откидываться назад, открывая и закрывая доступ к непарному яйцеводу. Закрывая просвет влагалища, он удерживает яйцо у отверстия протока семяприемника, сперму после осеменения матки, но и препятствует введению капилляра в непарный яйцевод.
Отверстие влагалища открывается в камеру, в центре которой расположено жало. Сверху жала находится анальное отверстие, под ним - преддверие влагалища, у основания которого, по бокам отверстия, расположены два совокупительных канала. При естественном спаривании маток в них входят рожки эндофаллуса трутня, а при инструментальном может попасть капилляр со спермой (если его неправильно вводят).
ИНСТРУМЕНТАЛЬНОЕ ОСЕМЕНЕНИЕ МАТОК ДЕФРОСТИРОВАННОЙ СПЕРМОЙ

Подсчет сперматозоидов, достигших семяприемника у искусственно осемененных маток разного возраста, показал, что маток можно успешно осеменять как на второй день после рождения, так и позднее. Но лучше всего осеменять маток в возрасте, соответствующем их естественной поре спаривания - с 6-го по 13-й день.
Число осеменений и количество спермы будут зависеть от цели использования пчелиной матки. Количество сперматозоидов, которое характерно для естественно спарившейся, полностью удовлетворяющее матку, чтобы она не пыталась вылететь на спаривание повторно, примерно 5 млн. Одно осеменение 8-10 мкл дефостированной спермы или два осеменения по 4 мкл каждое достаточны, так как обеспечивают необходимое количество сперматозоидов.
После инструментального осеменения маток обязательно метят цветом, соответствующим году, и помещают в клеточку Титова в сопровождении 5-10 пчел. Питомник с матками переносят в семью-воспитательницу, где их выдерживают в течение 10 дней, периодически в клеточки добавляют корм и удаляют мертвых пчел.
За период содержания маток в семье-воспитательнице у них проходят процессы миграции сперматозоидов из яйцеводов в семяприемник, созревания яиц и проходит желание вылетать на спаривание. После этого срока маток либо подсаживают в пчелиные семьи, отводки, либо реализуют.
Матки, осемененные в 10-дневном возрасте и выдержанные 10 дней после двукратного осеменения, имеют возраст 22 дня и, как правило, после подсадки в семью (еще 2 дня рекомендуется их содержать в закрытой клеточке, после чего ее заващивают, и на 25-й день пчелы выпускают маток) не требуется зарешечивание летков, так как в таком возрасте обычно матки уже не вылетают на спаривание.
По данным W.Foti (1973), миграция спермиев из парных яйцеводов в семяприемник происходит в течение 24-48 ч при температуре 28°.
ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ

Жидкий азот является криогеном с точкой кипения -196°. Газообразный азот не имеет цвета, запаха и вкуса, он не воспринимается органами чувств человека и при высокой концентрации в воздухе может вызвать головокружение и потерю сознания.
Совершенно необходимо знать и строго соблюдать правила техники безопасности при работе с жидкими газами!
Использовать жидкий азот только в хорошо проветриваемых помещениях.
Не переполнять контейнеры.
Не препятствовать испарению жидкого азота.
Не пользоваться полыми трубочками для измерения уровня жидкого азота.
Применять только контейнеры, предназначенные для низкотемпературных жидкостей.
Жидкий азот, заполняющий наружный сосуд Дьюара, охлаждающего устройства, кипит и разбрызгивается. Защищайте глаза и кожу.
Плохо закрытые ампулы после хранения содержат жидкий азот и в результате нагревания могут взрываться. Всегда надевайте очки, если достаете ампулы из жидкого азота и начинаете их размораживать.
Алюминиевый контейнер для хранения образцов после охлаждения до -196° начинает прилипать к коже. Работайте в перчатках.
БЛАГОДАРНОСТЬ
Технологические приемы по криоконсервации спермы трутней разрабатывались в течение 15 лет совместно с Институтом общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН (г.Москва). Выражаем глубокую благодарность ведущему сотруднику, доктору биологических наук Какпакову Виталию Туяковичу за предоставленную среду С46, организационную помощь и поддержку в выполнении работы.
smile.gif

Информаця стала возможной благодаря Витал Д.В. и модераторам . hi.gif friends.gif


--------------------
1-е Коринфянам 12:31
 ON  Карточка  Приват
 Наверх
andrey88055  
Вчера, 13:03
Сообщение #2034





Ульи: многокорпусные на рамку 145
Порода пчёл: карника
Пчело-стаж: 7-15 лет
Пчелосемей: 100-150
Регион нахождения пасеки: Украина

[>]


https://youtu.be/CEmeQ3cdZQU







Сообщение отредактировал andrey88055 - Вчера, 13:09
 OFF  Карточка  Приват
 Наверх

 Ответить  Опции  Открыть тему
 

Текстовая версия Сейчас: 20 Ноября 2019

Препарат Эндовираза 16.04.2018 Группа вКонтакте Колодное пчеловодство 01.09.2018